Что такое PRP?

PRP (Platelet Rich Plasma) – БОГАТАЯ Тромбоцитами Плазма.

PRP – это клеточная биотехнология, входящая в сферу регенеративной медицины, основанная на стимуляции пролиферативной активности прогенеторных клеток (клеток предшественников) факторами роста тромбоцитов.

Факторы роста – это специфические протеины, расположенные в альфа-гранулах тромбоцитов.

Точное понимание сути и тонкостей этой технологии определяет степень терапевтического или ревитализирующего эффекта.

Прежде чем углубиться в данную тему, хотелось бы акцентировать ваше внимание на медицинской технологии под торговым названием «Плазмолифтинг» как наиболее известной в медицинских (и не только) кругах. Как выяснилось, многие наши коллеги не видят разницы между Плазмолифтингом и PRP! Более того, считают, что это синонимы, т.е разные названия одной и той же медицинской технологии.

Но это не так!

Плазмолифтинг

это НЕ PRP (НЕ БОГАТАЯ Тромбоцитами Плазма)
это PРP (Platelet Poor Plasma) – БЕДНАЯ Тромбоцитами Плазма, с содержанием тромбоцитов меньше, чем в цельной крови.

Чем определяется терапевтическая эффективность инъекционной формы PRP?

Эффективность инъекционной формы PRP определяется двумя условиями:

Оптимальной концентрацией тромбоцитов
Жизнеспособностью тромбоцитов и факторов роста

Чтобы получить оптимальную концентрацию жизнеспособных тромбоцитов и факторов роста нужен инструмент – технология, позволяющая это сделать.

Сегодня в мире предлагается большое количество технологий, позволяющих по мнению их авторов получить плазму, богатую тромбоцитами. Порой разница между ними концептуальная, но чаще определяется нюансами, позволяющими одним получать PRP с хорошим терапевтическим эффектом, а другим нет.

Оптимальная концентрация тромбоцитов

! Первое условие эффективности PRP

Robert Marx – профессор, директор медицинского факультета университета в Майями(США) в 2004 году в своей статье «Богатая тромбоцитами плазма: доказательства ее эффективности» писал: «Haynesworth (Хейнсворт) с соавторами убедительно доказали, что пролиферация мезенхимальных стволовых клеток взрослого организма и их дифференцировка непосредственно связаны с концентрацией тромбоцитов (факторов роста). Они показали кривую доза-ответ, что свидетельствует о дозозависимости клеточной реакции мезенхимальных стволовых клеток. 4 – 5 кратное увеличение концентрации тромбоцитов в PRP по сравнению с базовым значением вызывает максимальную положительную реакцию мезенхимальных стволовых клеток».

Аналогичное исследование Луи с коллегами (Lui Y, Kalen A, Risto O, et al: Fibroblast proliferation due to exposure to a platelet concentrate in vitro is pH dependent. Wound Repair Regen 10:336, 2002) показало, что пролиферация фибробластов и производство коллагена 1 типа также были улучшены за счет увеличения концентрации тромбоцитов.

PRP – дозозависимая процедура.
1 миллион тромбоцитов в мкл – это эталон для терапевтически эффективной PRP.

Технология получения PRP – это формирование и забор

B U F F Y C O A T

с последующим разведением его плазмой крови до желаемой концентрации тромбоцитов.

Концентрацию тромбоцитов около 1 000 000 в микролитре плазмы можно получить только применяя технологию, позволяющую сформировать и забрать «BUFFY COAT» – лейкоцитарно-тромбоцитарный концентрат.

Не все технологии позволяют получить и забрать «BUFFY COAT»!

Жизнеспособность тромбоцитов и факторов роста

! Второе условие эффективности PRP

Важнейшие звенья, определяющие жизнеспособность тромбоцитов и факторов роста:

Правильный выбор антикоагулянта

Правильный выбор антикоагулянта является важнейшим (самым важным) условием получения терапевтически эффективной PRP. Антикоагулянт, используемый при производстве PRP должен не только блокировать свертываемость крови, то есть переход фибриногена в фибрин, но и препятствовать преждевременной активации тромбоцитов. Такими антикоагулянтами являются только антикоагулянты на основе цитрата натрия.

Что мы подразумеваем под активацией тромбоцитов?

Изменение агрегатного состояния тромбоцита с последующей дегрануляцией и выделением факторов роста. Необходимо помнить, что период полураспада, т.е. время жизни факторов роста после дегрануляции (активации) тромбоцитов составляет всего около 2-х минут. За первые 10 минут после активации тромбоциты секретируют около 70% факторов роста. Преждевременная, т.е. in vitro, активация тромбоцитов приведет к значительной количественной потере факторов роста!

Чем обусловлена активация тромбоцитов?

Активация начинается с момента потери контакта тромбоцитов с эндотелием кровеносного сосуда и любого механического напряжения. Наиболее сильными биологическими активаторами тромбоцитов считаются коллаген (главный белок внеклеточного матрикса), тромбин (основной белок плазменной системы свертывания), АДФ (аденозиндифосфат, появляющийся из разрушенных клеток сосуда или секретируемый самими тромбоцитами) и тромбоксан А2 (вторичный активатор, синтезируемый тромбоцитами). Для активации и изменения агрегатного состояния тромбоцита необходим эндогенный и, в большей степени, экзогенный кальций (Ca++).

Антикоагулянты:

Цитрат натрия

Цитрат натрия связывает экзогенный кальций крови, необходимый для изменения агрегатного состояния и активации тромбоцитов, тем самым лишает тромбоциты возможности преждевременной (in vitro) активации и дегрануляции (блокирует активацию тромбоцитов).

При производстве PRP во всем мире применяют антикоагулянты на основе цитрата натрия.

Гепарин

Действие на кровь гепарина заключается в стимулировании антитромбина-3, что тормозит образование тромбина и переход фибриногена в фибрин, т.е. предупреждает образование фибринового сгустка (блокирует коагуляциионный гемостаз). Гепарин не оказывает никакого влияния на предупреждение преждевременной активации и дегрануляции тромбоцитов. При использовании гепарина активация и дегрануляция тромбоцитов с выходом факторов роста начинается уже в момент забора крови и центрифугирования. Учитывая тот факт, что период полураспада (время жизни) факторов роста с момента активации тромбоцитов составляет всего 2 минуты, то большая часть факторов роста попадает в ткани в нежизнеспособном состоянии.

Следовательно, единственным антикоагулянтом, пригодным для получения инъекционной формы PRP является антикоагулянт на основе цитрата натрия. Кроме того, антикоагулянт должен содержать глюкозу для поддержания высокого метаболизма тромбоцитов и сохранения их жизнеспособности.

Центрифугирование

Для производства терапевтически эффективной PRP должна использоваться только центрифуга с подвесным бакет-ротором. В роторах с подвесными стаканами пробирки устанавливаются вертикально. Под действием возникающей центробежной силы пробирки переходят в горизонтальное положение с углом наклона к оси вращения в 90°. В центрифугах с угловым ротором пробирки установлены под фиксированным углом 30-40°, следовательно, при центрифугировании возникают конвекционные потоки, которые в значительной степени затрудняют разделение клеток крови. Конвекция является результатом того, что под действием центробежных сил частицы оседают под углом в 90°, т.е. строго перпендикулярно оси вращения центрифуги, а не 30-40°, как установлены пробирки и поэтому ударяются о стенки пробирки и соскальзывают на дно, что делает практически невозможным получение buffy coat! В 2005 году группа ученых из Сан-Франциско (UOP Arthur A. Dugoni School of Dentistry, San Francisco, CA.) пришла к выводу, что концентрация жизнеспособных тромбоцитов и факторов роста обратно пропорциональна центробежному ускорению (ОЦУ). Для производства терапевтически эффективной PRP должен применяться режим центрифугирования, не превышающий 700g. Режим центрифугирования, при котором относительное центробежное ускорение (ОЦУ) превышает 700g, приводит к разрушению и усилению преждевременной механической дегрануляции тромбоцитов. Чтобы этого не происходило, ОЦУ не должно превышать 700g. Относительное центробежное ускорение (ОЦУ) определяется количеством оборотов ротора в минуту и радиусом ротора в сантиметрах. ОЦУ можно определить по формуле или воспользоваться номограммой.

Вакуумный забор крови

При вакуумном способе забора венозной крови практически невозможно контролировать скорость потока забираемой крови. При существующих вакуумных системах стартовая турбулентность потока забираемой крови приводит к преждевременной механической активации тромбоцитов уже в процессе забора крови.

Нужно ли активировать тромбоциты IN VITRO

Некоторые методики производства PRP предусматривают активацию in vitro инъекционных форм PRP аутологичным тромбином или кальцием. При производстве инъекционных форм PRP необходимо помнить, что период полураспада, т.е. время жизни факторов роста после дегрануляции (активации) тромбоцитов всего около 2 минут! За первые 10 минут после активации тромбоциты секретируют около 70% факторов роста. Преждевременная, т.е. in vitro, активация тромбоцитов приведет к значительной количественной потере факторов роста! Во время инъекций PRP мы создаем в местах инъекций микрогематомы, следовательно, введенная нами PRP смешивается с кровью богатой Ca++ (необходимым для активации тромбоцитов), в которой запускается коагуляционный гемостаз с образованием тромбина - мощного активатора тромбоцитов.

Формула для определения относительного центробежного ускорения:

ОЦУ – Относительная центробежная сила

R – Расстояние от центра ротора до дна пробирки в сантиметрах

PRP должна быть активирована непосредственно в тканях и ни в коем случае заранее!

Концепция получения эффективной инъекционной формы PRP

PRP с лейкоцитами или нет?

Наличие лейкоцитов в PRP усиливает противоинфекционный, ангиогенный и регенеративный эффекты, опосредованные макрофагами (моноцитами) и лимфоцитами.

Стимуляторами пролиферации и ингибиторами апоптоза выступают факторы роста, продуцируемые:

макрофагами (моноцитами)
лимфоцитами
тромбоцитами

Среди этих участников макрофагам принадлежит ведущая роль.

РЕЗЮМЕ

Для получения 2 мл плазмы с пятикратным увеличением концентрации тромбоцитов относительно содержания их в цельной крови (200тыс – среднее содержание в крови), необходимо отобрать минимум 10мл крови
Необходимо использовать антикоагулянт, блокирующий преждевременную активацию тромбоцитов. Таким условиям отвечают только антикоагулянты на основе цитрата натрия
Относительное центробежное ускорение (ОЦУ) при центрифугировании крови не должно превышать 700g
Необходимо формировать и отбирать «Buffy Coat» - лейкоцитарно-тромбоцитарный концентрат, тонкий слой на границе сред, содержащий от 7 до 9 млн тромбоцитов в 1 мкл
Необходимо отбирать небольшое количество эритроцитов, содержащих юные, наиболее активные тромбоциты и моноциты
Не проводить преждевременной активации тромбоцитов